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恒鑫牌THI消泡剂

有机溶剂沉淀法提纯与高温消泡剂

发布时间:2012-12-10 20:23:05

1.有机溶剂的选择:有机溶剂沉淀蛋白质的能力随蛋白质的种类及有机溶剂的种类而不同。对曲霉淀粉酶而言,有机溶剂的沉淀能力,丙酮>异丙醇>乙醇>甲醇。这个顺序还受温度、高温消泡剂、PH、盐离子浓度所影响,不是一成不变的。 2.关于有机溶剂的用量:只能根据实验测定的沉淀曲线,因有机溶剂的沉淀能力受很多因素影响,特别是溶存盐类与高温消泡剂的影响尤为湿著。 当存在少量中性盐(0.1-0.2mol/L以上)时能产生盐溶作用,蛋白质在有机溶剂水溶液和高温消泡剂中的溶解度升高。多价阳离子与蛋白质结合,就能使蛋白质在水或有机溶剂中的溶解度降低,因而可以降低使酶沉淀的有机溶剂的浓度。 实践得到的参考范围如下:对过滤澄清的枯草杆菌淀粉酶或蛋白酶发酵液,每容积添加0.2-0.8容积的有机溶剂所得到的分部沉淀中含大量淀粉酶;添加0.8-1.1容积,分部沉淀物中含大量中性蛋白酶;添加1.1-1.4容积,分部沉淀物中含大量碱性蛋白酶。 3.其它变数的影响 (1)温度:有机溶剂沉淀蛋白质的能力受温度和高温消泡剂的影响很大。一般言之,温度越低沉淀越完全。局部区域有机溶剂过浓,能够严重破坏蛋白质的空间结构造成酶的变性失活,在温度较高的条件下尤为显著。有机溶剂,特别是乙醇与水混合时放出大量热,使混合液的温度升高。因此在添加有机溶剂时,整个系统需要冷却,一般保持0℃左右,同时强烈搅拌,以避免有机溶剂局部过浓和液体局部过热,而高温消泡剂则无事。另外,已经沉淀的酶对有机溶剂变性的抵抗力大,所以,过分延长添加溶剂的时间也是不利的。 (2) pH:蛋白质在等电点的溶解度最低,但很多酶的等电点在pH4-5,比其稳定的pH范围低。在这种情况下必须采用目的酶稳定的pH,然后是尽可能靠近其等电点。 沉淀时酶液的温度、高温消泡剂和pH不但对目的酶的收率具有决定性的影响,而且对酶的组成(各共存酶的比率)及单位重量沉淀物中目的酶的活力都有重要的关系。例如,固体培养的米曲霉ɑ-淀粉酶,用水抽出并过滤,清液预先冷却,在搅拌下加乙醇至终浓度70%,温度10℃,pH 5.6-6.0,ɑ-淀粉酶的收率约94%。 有机溶剂沉淀法有使酶变性失活的倾向,不如盐析法安全;有机溶剂还能使发酵液中的多糖类杂质沉淀,沉淀物中有机杂质多;另外分部沉淀的灵敏性方面也不如盐析法。 为了节省沉淀酶用的有机溶剂量,澄清的酶液应当先在减压条件下浓缩。但减压浓缩的倍数是很有限的,对枯草杆菌酶发酵液的澄清液,一般只能浓缩到原体积的40-50%,否则有机溶剂的沉淀物呈胶糖状,很难处理。但若在浓缩的酶液中先加入一定量的高岭土、硅藻土之类,加有机溶剂与高温消泡剂后酶的沉淀就分散在这些载体上,沉淀物就比较容易收集。有机溶剂沉淀物特别适宜于用离心分离法收集。 本文参考《发酵微生物学》一书。
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